腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）無論在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。AAV可以感染大量種類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在人體內(nèi)只產(chǎn)生極低的免疫原性，這些特點(diǎn)使重組AAV成為當(dāng)今應(yīng)用于基因治療的高效病毒載體。在基因治療的臨床前和臨床階段的研究中，可通過Baculovirus-AAV嵌合病毒載體高效且大規(guī)模生產(chǎn)重組AAV以符合劑量和安全性要求。

利用桿狀病毒（Baculovirus）生產(chǎn)重組AAV需要將兩種桿狀病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)昆蟲Sf9細(xì)胞。第一種桿狀病毒表達(dá)位于兩個(gè)AAV ITR元件之間的目的基因，第二個(gè)桿狀病毒表達(dá)AAV rep和cap基因。為制備兩種桿狀病毒，每種桿狀病毒的表達(dá)框均被克隆至一個(gè)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。該質(zhì)粒的整個(gè)表達(dá)框與慶大霉素（Gentamycin）抗性基因位于質(zhì)粒上的兩個(gè)Tn7轉(zhuǎn)座子末端序列之間（Tn7L和Tn7R）。該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至帶有桿粒（Bacmid）和輔助載體的大腸桿菌。桿?？梢员豢醋饕粋€(gè)特別巨大的質(zhì)粒，包含了修飾過后的桿狀病毒基因組序列。該序列上帶有l(wèi)acZ基因以及位于該基因內(nèi)部的attTn7位點(diǎn)。因此轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上兩個(gè)Tn7之間的序列通過Tn7轉(zhuǎn)座酶與桿粒重組后將插入lacZ基因，隨后通過慶大霉素抗性篩選和藍(lán)白篩選即可獲得重組成功的大腸桿菌。從大腸桿菌提取的桿粒純化后用于轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞。

我們的baculovirus-AAV嵌合病毒載體表達(dá)的定制目的基因位于兩個(gè)AAV ITR元件之間。利用該載體生產(chǎn)的重組桿狀病毒與表達(dá)AAV rep和cap基因的輔助桿狀病毒可共轉(zhuǎn)導(dǎo)至昆蟲細(xì)胞，然后利用昆蟲細(xì)胞中大規(guī)模制備重組AAV。

使用AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時(shí)，兩個(gè)ITR之間的外源DNA及病毒基因組一同進(jìn)入細(xì)胞，線性雙鏈DNA基因組以游離體DNA的形式存在于細(xì)胞核中。在分裂細(xì)胞中，由于游離體DNA不跟隨細(xì)胞復(fù)制，AAV基因組將隨著細(xì)胞分裂逐漸丟失，因此在整體細(xì)胞中被稀釋。重組AAV的DNA隨機(jī)整合宿主基因組的現(xiàn)象是非常罕見的，這對于需要考慮外源DNA插入宿主基因組引發(fā)致癌風(fēng)險(xiǎn)的基因治療來說是相當(dāng)適用的特點(diǎn)。

AAV的另一個(gè)應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)在于，在大多數(shù)情況下，可以在生物安全1級（BSL1）設(shè)施中完成操作。重組AAV是復(fù)制缺陷型的，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)和引發(fā)人類疾病。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據(jù)病毒表面衣殼蛋白的不同抗原將它們分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性（即感染組織特異性）。當(dāng)我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時(shí)，則會(huì)賦予病毒不同的血清型。目前我們使用Baculovirus-AAV嵌合病毒載體包裝的AAV提供以下幾種血清型：AAV1、2、6、8和9。AAV包裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這是一種常用的AAV載體構(gòu)建方式，不影響血清型。另一方面，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質(zhì)粒編碼。關(guān)于AAV的更多血清型信息，請參照下表。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參照以下文獻(xiàn)。

Baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以用于高效地并大規(guī)模生產(chǎn)重組AAV。我們的載體系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化，可以在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)形式復(fù)制，中間需要包裝出高滴度的重組桿狀病毒，最后制備的AAV具有很低的安全風(fēng)險(xiǎn)。

高效與易放大：Sf9昆蟲細(xì)胞可以在大型生物反應(yīng)器中以高密度的懸浮細(xì)胞方式培養(yǎng)，因此用其生產(chǎn)AAV，對比傳統(tǒng)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備AAV的方法更高效、生產(chǎn)上更易放大規(guī)模。

安全性高：桿狀病毒對于哺乳動(dòng)物和植物是非致病性的，并且不能在昆蟲細(xì)胞外復(fù)制。因此，使用昆蟲細(xì)胞株的生產(chǎn)環(huán)境僅需要最低的生物安全等級。此外，昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)使用的是無血清培養(yǎng)基，排除了任何動(dòng)物源成分，進(jìn)一步強(qiáng)化了該載體系統(tǒng)的生物安全性。使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的重組AAV仍然是復(fù)制缺陷型的，不會(huì)引發(fā)任何人類疾病。

對宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，AAV基因組在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以包裝成高滴度的AAV病毒。經(jīng)Sf9昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的AAV病毒其滴度可達(dá)到>10¹³ GC/ml。

宿主范圍廣：針對不同來源的常用哺乳動(dòng)物（如人、小鼠和大鼠）細(xì)胞和組織，將我們的AAV載體包裝成對其具有親和性的血清型，可輕易實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，某些類型的細(xì)胞仍然難以轉(zhuǎn)導(dǎo)（見下文不足之處），這與所用的血清型有關(guān)。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

載體容量?。?/strong>AAV是我們所有病毒載體系統(tǒng)中裝載量最小的。AAV的兩個(gè)ITR之間所能容納的最大序列長度是4.7 kb，允許使用者插入~4.2 kb的目的序列。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：當(dāng)利用合適的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多不同類型的細(xì)胞，包括非分裂細(xì)胞。不同AAV血清型對不同類型的細(xì)胞具有不同的嗜性，針對某種特定類型的細(xì)胞需要特定血清型。 

技術(shù)復(fù)雜：通過baculovirus-AAV表達(dá)系統(tǒng)生成重組AAV需要多個(gè)步驟，包括克隆目的基因至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體、從轉(zhuǎn)移載體制備重組桿粒、桿粒轉(zhuǎn)染并使用桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)昆蟲細(xì)胞等，這些步驟相對于傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)AAV具有更高的技術(shù)復(fù)雜性、花費(fèi)時(shí)間也更長。通過訂購我們的基于baculovirus-AAV嵌合病毒載體的AAV包裝服務(wù)可以輕松解決這些問題。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Tn7L: Tn7 transposon left terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Gentamicin: Gentamicin resistance gene. It allows for drug selection of E. coli carrying recombinant bacmids.